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针对上述问题，苏州大学殷黎晨教授团队针对cfDNA-ROS-细胞因子三者的正反馈网络，设计并构建了一种多功能纳米平台RAW264.7细胞膜包覆的CeO₂纳米粒（RM-CeO₂）,能够同时、高效、稳定清除三类炎症介质。该平台在体外/体内模型中验证了其同步捕获cfDNA、清除ROS并中和关键促炎细胞因子的能力，显著打破炎症循环，缓解自身免疫病理损伤，且具备良好的生物相容性与长效稳定性，为AIDs的联合靶向治疗给予了新策略。该文章于2025年7月22日以《Biomimetic Immunoregulators for the Multi-Target Inflammation Interruption in Autoimmune Diseases》为题发表于《ACS Nano》（DOI:10.1021/acsnano.5c04655）。

图1 研究示意图

（1）NPs的制备和表征和H₂O₂触发膜脱落

CeO₂ 纳米粒子（平均粒径 42.6 nm，ζ 电位 +26.0 mV）表面 Ce³⁺/Ce⁴⁺ 共存（50.7 % / 49.3 %），兼具捕获并剪切 cfDNA 的双重功能。采用超声融合法将 RAW264.7 细胞膜（RM）均匀包覆于 CeO₂，构建核–壳结构 RM-CeO₂ NPs。当 RM 蛋白与 CeO₂ 质量比为 1 : 4 时，粒径最小（55.3 nm），ζ 电位逆转至 −18.5 mV（图 2a,b）。TEM 可见陆续在膜层（图 2c），室温静置 1 个月仍无沉淀（图 S3）。DiO-RM-Cy5-CeO₂ 离心后上清荧光残留 <15 %，证实膜包覆完整。Western blot 显示 LFA-1、TNF-αR、IL-6R、IL-1βR、IFN-γR 等关键受体均得以保留（图 2d）。盐溶液中，裸 CeO₂ 在 200 μg mL⁻¹ 即聚集，而 RM-CeO₂ 至 1 000 μg mL⁻¹ 仍澄清。10 % FBS 孵育 8 h 后，裸粒子粒径显著增大且 ζ 电位转负，而 RM-CeO₂ 尺寸与电位均保持稳定（图 2e,f）。RAW264.7 摄取实验表明，膜包覆使摄取量下降 2.3 倍（图 2g）。

与 5 mM H₂O₂ 共孵 1 h，CeO₂ 与 RM-CeO₂ 均产生明显气泡（图 2h），溶解氧检测显示二者产氧速率相近（图 2i）。100 μM H₂O₂ 处理 4 h 后，RM-CeO₂ 粒径由 55.3 nm 增至 330.4 nm，ζ 电位由负转正（图 2j,k）；而在 8 μM H₂O₂（生理水平）作用 24 h 内，粒径与电位均无明显变化。FRET 实验显示，100 μM H₂O₂ 处理 4 h 后，Cy3-RM-Cy5-CeO₂ 的 FRET 效率由 0.15 降至 0.08，伴随 Cy5 荧光减弱及 Cy3 荧光恢复（图 2l）。CLSM 进一步证实，DiO-RM-FITC-CeO₂ 经 100 μM H₂O₂ 刺激 4 h 后，共定位信号分离，Pearson 系数由 0.89 降至 0.17（图 2m,n）。

图2 RM-CeO₂纳米粒的表征及H₂O₂触发膜脱落行为。（a，b）RM囊泡、CeO₂与RM-CeO₂的粒径及ζ电位（n=3）；（c）CeO₂与RM-CeO₂的TEM图像；（d）RM囊泡与RM-CeO₂的Western blot蛋白谱；（e，f）10%FBS-DMEM中孵育不同时间后CeO₂与RM-CeO₂的粒径及ζ电位变化（n=3）；（g）RAW264.7细胞与Cy5CeO₂或RM-Cy5CeO₂共孵4 h后的流式直方图及单细胞平均荧光强度（n=3）；（h）5 mM H₂O₂处理1 h后CeO₂与RM-CeO₂分散状态照片；（i）200 mM H₂O₂中不同时间产生的O₂量（n=3）；（j，k）100 μM H₂O₂孵育不同时间后RM-CeO₂的粒径与ζ电位变化（n=3）；（l）100 μM H₂O₂处理4 h前后Cy3RM-Cy5CeO₂的FRET光谱（括号内为效率）；（m）100 μM H₂O₂处理4 h前后DiORM-FITCCeO₂的CLSM图像；（n）对应（m）中FITCCeO₂与DiORM的Pearson相关系数（n=3）

（2）RM-CeO₂纳米粒体外功能表征

BNPP 模型显示，CeO₂ 对 DNA 的水解常数 Vmax = 4.70×10⁻⁵ s⁻¹，Km = 1.80 mM；细胞膜包覆后活性骤降，而 100 μM H₂O₂ 预处理 4 h 可剥除膜层，使 RM-CeO₂ 的 Vmax（4.48×10⁻⁵ s⁻¹）与 Km（1.74 mM）几乎完全复原（图 3a,b）。FAM-BHQ-1 TaqMan 探针实验表明，RM-CeO₂ 单独作用 9 h 荧光无升高，H₂O₂ 预处理后荧光迅速回升，并能在陆续在四轮补充探针中保持切割效率；即使 CeO₂/探针质量比降至 2，仍可实现完全降解。琼脂糖凝胶显示，≥25:1 时 CeO₂ 开始结合 pDNA，≥100:1 时完全结合；4 h 后 ≥25:1 条带出现小片段，≥100:1 条带消失（图 3d）。RAW264.7 超声裂解产生的 DAMPs 经 CeO₂ 或 H₂O₂ 预处理 RM-CeO₂ 处理后均被高效剪切（图 3e），并分别使 HEK-Blue mTLR9 细胞的 TLR9 激活降低 47% 与 50%（图 3f）。与 PAMAM-G3 相比，H₂O₂ 预处理的 RM-CeO₂ 在血清和肝素存在下仍能彻底清除 CpG，避免竞争置换导致的 cfDNA 再暴露（图 S10）。ROS 清除实验表明，CeO₂ 与 RM-CeO₂ 对 H₂O₂、O₂⁻、·OH 均具同等高效清除能力（图 3g）。细胞因子中和实验显示，RM-CeO₂ 可浓度依赖地抑制 TNF-α、IL-6、IL-1β，IC₅₀ 分别为 735、1634、1296 μg/mL，而红细胞膜包覆的 EM-CeO₂ 几乎无效。

图3 RM-CeO₂纳米粒体外功能表征。（a）BNPP底物饱和度曲线（n=3）；（b）Lineweaver-Burk双倒数图（n=3）；（c）TaqMan探针荧光时间曲线，箭头示0、2、4、6 h补加探针（n=3）；（d）递增CeO₂/pDNA质量比下pDNA 4 h琼脂糖凝胶图；（e）超声DAMPs经PBS、CeO₂、RM-CeO₂或H₂O₂预处理RM-CeO₂处理后的琼脂糖凝胶图；（f）DAMPs存在时HEK-Blue mTLR9细胞TLR9激活水平（n=3）；（g）CeO₂与RM-CeO₂对H₂O₂、O₂⁻、·OH的残留量（n=3）；（h）RM-CeO₂不同浓度下TNF-α、IL-6、IL-1β残留浓度（n=3）

（3）体外抗炎和抗氧化RM-CeO2 NPs的效率

在RAW 264.7细胞模型中，经CpG、LPS、IL-1β、超声或阿霉素诱导的DAMPs刺激后，100 μM H₂O₂预处理4 h的RM-CeO₂纳米粒较裸CeO₂及RM囊泡更显著降低TNF-α与IL-6分泌（图4a、b）；200 μg/mL CeO₂条件下，RM-CeO₂无论是否经H₂O₂预处理均无明显细胞毒性，且对未受刺激细胞的TNF-α/IL-6分泌影响极小（图S13）。LPS（10 ng/mL）刺激使RAW 264.7细胞ROS水平显著升高并伴随形态激活，CeO₂与RM-CeO₂处理将胞内ROS降低约98%，细胞保持静息形态，RM囊泡无此效应（图4c）。

图4 RM-CeO₂纳米粒的体外抗炎与抗氧化效能。（a）RAW264.7细胞经CpG、LPS、IL-1β、超声DAMPs或Dox-DAMPs刺激后与不同纳米粒共孵24 h的TNF-α分泌水平（n=3）；（b）对应IL-6分泌水平（n=3）；（c）RAW264.7细胞与LPS及不同纳米粒共孵24 h后经DCFH-DA染色的CLSM图像及每细胞平均荧光强度（n=3）

（4）RM-CeO2 NPs与商业清除剂免疫调节效率的比较

在10 μg/mL PAMAM-G3、5 μg/mL CAT 和 1 μg/mL 抗TNF-α 分别与 50 μg CeO₂/mL RM-CeO₂ 等效清除 CpG、H₂O₂ 与 TNF-α的条件下，将 RAW264.7 细胞同时暴露于 CpG/H₂O₂/TNF-α 混合物后，RM-CeO₂ 较三种单靶点清除剂显著降低 TNF-α 与 IL-6 分泌，并抑制胞内 H₂O₂ 水平（图 5a–c）。在 Transwell 共培养体系中，经 CpG/H₂O₂/TNF-α 刺激的 RAW264.7 细胞诱导新生 RAW264.7 向 M1 极化、DC2.4 成熟，并触发中性粒细胞 NETs（dsDNA、MPO、MMP-9）生成；RM-CeO₂ 处理显著抑制上述免疫激活，而单靶点清除剂作用有限（图 5d–k）。

图5 RM-CeO₂纳米粒与商品化清除剂的免疫调控效能比较。（a）RAW264.7细胞与CpG/H₂O₂/TNF-α混合物及PBS、RM-CeO₂、PAMAM-G3、CAT或抗TNF-α共孵24 h后的TNF-α分泌水平（n=3）；（b）对应IL-6分泌水平（n=3）；（c）胞内H₂O₂水平（n=3）。（d）RAW264.7细胞流式直方图；（e）由d计算所得M1型巨噬细胞（CD86⁺）比例（n=3）；（f）M2型巨噬细胞（CD206⁺）比例（n=3）。（g）DC2.4细胞流式直方图；（h）由g计算所得成熟树突状细胞（CD40⁺CD80⁺）比例（n=3）。（i）中性粒细胞培养上清中dsDNA浓度（n=3）；（j）MPO浓度（n=3）；（k）MMP-9浓度（n=3）

（5）NPs的药代动力学、生物分布和体内氮气释放

静脉注射后，RM-^Cy5CeO₂与EM-^Cy5CeO₂的循环半衰期分别为^Cy5CeO₂的5.0倍与4.6倍（图6a）；CIA模型鼠踝关节荧光显示RM-Cy5CeO₂强度为^Cy5CeO₂的3.2倍、EM-^Cy5CeO₂的2.1倍（图6b、c），且第4天关节信号降至峰值15%以下，肝脏累积低于^Cy5CeO₂。ConA诱导AIH模型中，RM-^Cy5CeO₂肝脏累积为^Cy5CeO₂的3.5倍，健康与AIH肝脏细胞外比例均>80%，肝巨噬细胞摄取显著低于裸CeO₂。光声成像示CIA踝关节在注射RM-CeO₂后1 h O₂信号显著增强（图6d）；FRET检测表明血循环中Cy3RM-^Cy5CeO₂的FRET效率24 h不变，而CIA关节24 h效率明显降低（图6e、f），健康关节内FRET效率恒定。CIA小鼠中，RM-CeO₂显著降低滑膜液与血清cfDNA及dsDNA水平，CeO₂因关节富集不足而滑膜清除效率低，血清清除与RM-CeO₂相当。

图6 RM-CeO₂纳米粒的药动、分布及体内膜脱落。（a）健康小鼠静脉注射后血浆Cy5CeO₂、EM-Cy5CeO₂与RM-Cy5CeO₂浓度曲线及括号内半衰期（n=3）；（b）CIA小鼠静脉注射Cy5CeO₂制剂后不同时间荧光成像；（c）24 h离体踝关节荧光成像及定量强度（n=3）；（d）CIA及健康小鼠踝关节静脉注射PBS或RM-CeO₂后不同时间氧合血红蛋白光声成像；（e）静脉注射Cy3RM-Cy5CeO₂后4 h与24 h血液及滑膜FRET效率（n=3）；（f）静脉注射Cy3RM-Cy5CeO₂后4 h与24 h离体踝关节FRET信号荧光成像（λex=550 nm，λem=670 nm，n=3）

（6）RM-CeO₂纳米粒治疗CIA小鼠的疗效

CIA小鼠经RM-CeO₂干预后，关节肿胀与体重下降显著缓解，临床评分最低（图7a,b）；血清及滑膜cfDNA、dsDNA及TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-α水平均显著低于CeO₂组（图7c、d），MMP-1、-2、-3、-9下调50–60%。滑膜H₂O₂与ROS恢复至正常水平（图7e），MPO降低71%（图7f）。与抗TNF-α相比，RM-CeO₂在下调TNF-α外仍显著降低其他炎症介质与dsDNA，关节消肿更优。流式结果显示，RM-CeO₂使滑膜浸润巨噬细胞（F4/80⁺CD11b^high）减少51%，M2型比例升高、M1型降低（图7g–j），并抑制CD3⁺T细胞向Th1（IFN-γ⁺）和Th17（IL-17⁺）分化。

图7 RM-CeO₂纳米粒治疗CIA小鼠的疗效。（a）体内实验时间轴；（b）实验全程后肢厚度变化（n=6）；（c）第57天血清cfDNA与dsDNA浓度（n=6）；（d）第57天滑膜促炎细胞因子水平（n=6）；（e）第57天滑膜H₂O₂含量（n=6）；（f）第57天滑膜MPO含量（n=6）；（g）第57天滑膜细胞流式直方图；（h）由g计算的浸润巨噬细胞（F4/80⁺CD11b^high）比例（n=6）；（i）M1型巨噬细胞（F4/80⁺CD11b⁺CD86⁺）比例（n=6）；（j）M2型巨噬细胞（F4/80⁺CD11b⁺CD206⁺）比例（n=6）

（7）RM-CeO₂纳米粒在CIA小鼠中的关节保护与运动功能恢复

H&E染色显示RM-CeO₂使滑膜增厚及粒细胞浸润显著受抑，组织学评分下降74%（图8a、d）；番红O与Masson染色示其软骨退变及纤维化面积分别减少86%与65%，疗效优于CeO₂（图8b、c、e、f）。Micro-CT示关节表面骨侵蚀明显减轻（图8g），骨密度、骨表面积/体积、骨表面积密度及骨小梁厚度均恢复至健康鼠水平（图8h–k）。RM-CeO₂处理后CIA小鼠最大耐受转速由17 rpm升至70 rpm，运动功能恢复（图8l）。

图8 RM-CeO₂纳米粒在CIA小鼠中的关节保护与运动功能恢复。（a–c）关节切片H&E、番红O及Masson染色代表性显微图（标尺100 μm）；（d）由a计算的组织学评分（n=6）；（e）由b计算的软骨退变等级（n=6）；（f）由c计算的纤维化面积（n=6）；（g）右踝关节Micro-CT代表性图像，红色圆圈示骨破坏区域；（h–k）由g计算的骨密度、骨表面积/体积、骨表面积密度及骨小梁厚度（n=6）；（l）CIA小鼠最大耐受转速（n=6）

（8）RM-CeO₂纳米粒治疗AIH小鼠的疗效

AIH小鼠经RM-CeO₂干预后，体重回升，肝脾指数恢复（图9b、c）；血清cfDNA与dsDNA分别下降82%和79%（图9d），肝脏TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-α、IFN-γ、IL-17A降至正常，IL-4与IL-10分别升高1.3倍和2.4倍（图9e）；ROS、MDA下降，GSH/GSSG升高，MPO降低71%（图9f–i）。流式显示肝F4/80⁺CD11b^high巨噬细胞减少66%，M1型下降、M2型上升，Th1与Th17分别减少68%和70%。H&E示肝坏死、浸润及脂肪变性改善，临床评分降低64%，肝凋亡减少86%（图9j–m）。健康小鼠静脉注射10 mg/kg RM-CeO₂后，主要器官无病理损伤，血常规与生化指标基本正常。

图9 RM-CeO₂纳米粒治疗AIH小鼠的疗效。（a）体内实验时间轴；（b）AIH小鼠肝指数（n=6）；（c）AIH小鼠脾指数（n=6）；（d）血清cfDNA及dsDNA浓度（n=6）；（e）肝脏细胞因子水平（n=6）；（f）肝脏ROS水平（n=6）；（g）肝脏MDA水平（n=6）；（h）肝脏GSH/GSSG比值（n=6）；（i）肝脏MPO水平（n=6）；（j）肝脏H&E染色代表性图像（标尺100 μm，黄、红、绿箭头分别示炎症浸润、坏死及脂肪变性）；（k）由j计算的临床评分（n=6）；（l）肝脏TUNEL染色代表性图像（标尺20 μm，DAPI染核）；（m）由l计算的凋亡指数（n=6）